細胞不貼壁問題解析

細胞貼壁細胞（除腫瘤細胞外）在體外培養條件下，完成貼壁后均為單層生長，原因是貼壁細胞有接觸性抑制的特點。一般認為接觸抑制是細胞間的一種識別作用，對于動物細胞的形態形成與穩定具有重要性的作用。由于貼壁細胞的一面是緊貼在培養瓶上的，如果其上方存在細胞與其相粘附，那么下方的細胞很快就會缺乏營養餓死。

不貼壁的一些原因：

1. 胰酶消化時間把控不當：消化不夠細胞本身就是成團的；若胰酶處理太久，容易造成細胞膜蛋白損傷，使細胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強，嚴重的時候甚至會造成細胞死亡。

2. 缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無血清培養基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細胞的貼壁效果會下降很多。

3. 支原體或細 菌的污染。

4. 培養液配制、儲存不當，如pH值過堿，Gln量太少等原因。

5. 復蘇的細胞本身狀態不好，已經老化，失去貼附性。

6. 接種細胞數目太少，無法分泌足夠的細胞外基質。

7. 復蘇時處理速度太慢，復蘇過程不當。

如何促進細胞貼壁：

1. 適度消化細胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養基打散。

2. 用塑料瓶培養，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養瓶，或者用鹽酸對培養瓶進行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細胞貼附新的培養瓶，細胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

3. 正確配制消化液或培養液。

4. 使用合適的細胞外基質或貼壁試劑。

5. 復蘇新的細胞，第1周用20%血清幫助細胞復原。

6. 傳代接種一定要鋪的均勻，避免細胞抱團生長。

7. 細胞傳代24小時之內，不要晃動，以免影響貼壁。

8. 體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜上，因此培養在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細胞培養，可以用γ射線照射后的3T3細胞為飼養層，另外降低pH、Ca2+含量和溫度，均有利于上皮細胞生長。