時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）原理主要步驟

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實(shí)時(shí)擴(kuò)增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針，當(dāng)與擴(kuò)增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出信號(hào)，從而可以對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達(dá)分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。

RT-qPCR原理主要步驟：

1 反轉(zhuǎn)錄：

?使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

?該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。

?反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。

2 PCR擴(kuò)增：

?使用特定引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域。

?PCR是一個(gè)循環(huán)過程，呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增DNA模板的數(shù)量。

?PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針，它們結(jié)合到擴(kuò)增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號(hào)。

3 熒光實(shí)時(shí)檢測：

?使用實(shí)時(shí)PCR儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)。

?熒光的數(shù)量與每個(gè)PCR循環(huán)中擴(kuò)增的DNA數(shù)量成比例。

?使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號(hào)達(dá)到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計(jì)算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量，從而允許進(jìn)行基因表達(dá)或病毒載量等定量分析。