逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)要素分析

逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）是以 RNA 為模板合成 DNA 的過(guò)程，即 RNA 指導(dǎo)下的 DNA 合成，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)包括3大要素，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板：

1. 引物：逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個(gè) T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對(duì)，可合成全長(zhǎng)的 cDNA，但僅擴(kuò)增有 polyA 尾的 mRNA ，對(duì)模板質(zhì)量要求高，較適合克隆實(shí)驗(yàn)。而 Random Primers 具有6-9個(gè)堿基，可隨機(jī)識(shí)別模板并結(jié)合，適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續(xù) qPCR 實(shí)驗(yàn)。基因特異性引物可以識(shí)別特定模板序列，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，但需合成特定的序列。所以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可進(jìn)行相應(yīng)引物的選擇。

2. 逆轉(zhuǎn)錄酶：一種是來(lái)自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的 RNaseH 活性，它合適溫度是42℃，合適 pH8.3，在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除 mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長(zhǎng)度。另一種來(lái)源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有 RNA 聚合酶活性和相對(duì)較弱的 RNaseH 活性，合適溫度37℃，合適 pH7.6，較弱的  RNaseH 活性對(duì)獲得2-3kb的 mRNA 的全長(zhǎng) cDNA 有很大好處。

3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品），28S rRNA  條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無(wú) gDNA 和蛋白殘留。